Studi dan evaluasi karsinogenesis

Karsinogenesis dipelajari dengan berbagai tes toksikologi standar. Bagian pertama dari tes ini dilakukan secara in vitro, dan - jika hasilnya positif - kami melanjutkan dengan eksperimen in vivo. Pendekatan langkah-demi-langkah eksperimental ini disebut PENDEKATAN POIN KEPUTUSAN, urutan percobaan yang berhenti di akhir setiap percobaan untuk memutuskan bagaimana melanjutkan percobaan. Ada lima tahap:

FASE A: struktur dan karakteristik senyawa karsinogenik;

FASEB: dalam fase pengujian in vitro jangka pendek ini, sel mamalia digunakan. Sel yang paling umum digunakan adalah hepatosit, karena tingkat perbaikan kerusakan yang berkembang hepatosit sesuai dengan tingkat keparahan kerusakan yang disebabkan oleh zat dipelajari. Singkatnya, kami tidak menentukan kerusakan itu sendiri, tetapi seberapa banyak sistem perbaikan yang telah diaktifkan oleh sel hati.

Prosedur yang dilakukan adalah membentuk 3 kultur hepatosit. Pada biakan pertama hepatosit dalam keadaan sehat, pada biakan kedua diberi bahan uji dan terakhir pada biakan ketiga diberi bahan kontrol yang tentunya bersifat karsinogenik.Ketiga kultur ini mengandung basa pirimidin radioaktif, yaitu timidin tritiasi, yang bertindak sebagai penanda.

Jika senyawa yang diperiksa menyebabkan mutasi pada DNA, sel merespons masalah ini dengan mengaktifkan sistem perbaikan. Bagian DNA yang telah mengalami mutasi dipotong dan berkat kerja DNApolymerase, bagian yang hilang diganti dengan yang baru.Untuk koreksi, DNApolymerase menggunakan basa baru, termasuk timidin tritiated. Basa radioaktif dimasukkan. Analisis radioaktivitas menentukan tingkat mutasi pada sel yang dirawat: semakin tinggi radioaktivitas, semakin besar mutasi DNA.

Juga pada tes fase B juga dilakukan pada bakteri, untuk dapat mempelajari apakah ada mutasi terbalik. Bakteri yang digunakan adalah salmonella yang sudah menjadi pembawa mutasi. Mutasi tersebut menyangkut sintesis histidin, sehingga salmonella tidak dapat tumbuh tanpa histidin. Koloni bakteri ini sebagian diambil untuk diobati dengan zat uji, sebagian untuk kontrol negatif dan sebagian untuk kontrol positif, kemudian diuji dengan karsinogen yang diketahui. Jika zat uji ini merupakan genotoksik tidak langsung, enzim metabolisme harus dimasukkan ke dalam media kultur. Pada saat ini ada 3 kultur yang akan disemai dan ditumbuhkan dalam cawan petri (tidak ada histidin dalam media kultur).Jika belum ada mutasi oleh karsinogen yang akan diuji, secara teori seharusnya tidak ada pada cawan tersebut. Jika ada tindakan mutagenik dari karsinogen, mungkin telah mengubah mutasi pertama dan menciptakan mutasi kedua yang mampu menumbuhkan bakteri pada media kultur bebas histidin. Dalam hal ini, mutasi kedua yang memodifikasi mutasi pertama dan mengambil nama RETROMUTASI Akhirnya, jika pertumbuhan yang signifikan terjadi pada piasta petri, karsinogennya langsung.
Selalu dengan tes in vitro dimungkinkan untuk menentukan integritas kromosom. Tes ini selalu dilakukan pada sel mamalia dan digunakan untuk menguji zat beracun yang mampu menyebabkan mutasi pada beberapa enzim yang bertanggung jawab untuk biosintesis DNA. Zat yang akan diuji digunakan untuk analisis in vitro Untuk dapat menentukan apakah zat yang diperiksa mempengaruhi integritas dan jumlah kromosom yang ada, digunakan uji mikronukleus. Mikronukleus adalah vesikel yang terbentuk dengan bagian kromatin di dalamnya.Kromatin yang tergabung dalam mikronukleus ini dapat berupa seluruh kromosom atau fragmen kromosom.Mikronukleus dibentuk oleh pembelahan sel yang salah sehingga menghasilkan sel anak dengan materi genetik tidak sama terdistribusi.Hasil pengujian ini akan ditentukan zat yang terdefinisi racun klastogenik dan spindel. Zat klastogenik menghasilkan mikronukleus dengan fragmen kromosom yang asentrik sehingga zat tersebut menginduksi pemutusan pada kromosom, sebaliknya zat racun dari gelendong menghasilkan mikronukleus yang di dalamnya terdapat seluruh kromosom.
Jika zat yang diperiksa menginduksi genotoksisitas dalam satu atau lebih tes, ini didefinisikan sebagai sangat mencurigakan, sehingga langsung menuju ke fase D. Jika, sebaliknya, zat yang diuji tidak menghasilkan efek genotoksik, ia lolos ke fase studi C karena dapat menjadi promotor.

FASEC: pada fase ini tes in vitro dan in vivo dapat dilakukan.

Untuk tes in vitro dapat ditunjukkan kemungkinan zat promotor untuk memecahkan gap-junction antara sel normal dan sel tumor, dengan konsekuensi lewatnya zat antara dua sel.

Tes in vivo adalah induksi tumor kulit pada tikus. Zat yang akan diuji dioleskan dua atau tiga kali dalam seminggu ke kulit tikus. Dalam 2/3 bulan jika zat ini adalah promotor mungkin ada pembentukan papiloma. Pada tikus, dua data utama dipertimbangkan: jumlah tikus yang terkena papiloma dan jumlah papiloma yang ada pada setiap hewan. Jika zat tersebut bertindak sebagai promotor dan mengembangkan tumor pada tikus yang dirawat, itu berarti zat tersebut memang memiliki efek promotor.

Setelah tes ini selesai, kami beralih ke tes in vivo jangka panjang.

FASED: pada fase ini semua senyawa yang terbukti mutagenik dan semua senyawa yang tidak terbukti mutagenik diuji. Tes yang bisa dilakukan berbeda-beda, beberapa di antaranya adalah tes yang dilakukan pada hati, pada paru-paru dan terakhir pada payudara.

Tes hati menunjukkan pembentukan bukan tumor yang baru terbentuk, tetapi fokus neoplastik, oleh karena itu sesuatu yang bersiap untuk menjadi tumor. Sel-sel fokus ini sudah menjadi sel atipikal, oleh karena itu mereka telah mengalami mutasi dan bersiap untuk menjadi sel neoplastik. Setelah waktu tertentu, berkat pemeriksaan otopsi, pembentukan fokus pra-neoplastik ditentukan, dengan menghitung jumlah dan luasnya formasi pra-neoplastik ini.

Tes paru-paru memungkinkan penentuan adenoma, yang merupakan "anomali sel-sel jaringan paru-paru. Juga dalam hal ini jaringan paru-paru tikus diperiksa setelah waktu yang cukup lama (berbulan-bulan) (adenoma ini mudah diidentifikasi karena adalah nodul keputihan pada epitel paru).
Tes payudara memungkinkan penentuan tumor di jaringan kelenjar. Jumlah adenoma yang terbentuk dan jumlah hewan yang menunjukkan adenoma selalu dievaluasi.

Jika ada hasil positif dari tes ini, zat uji benar-benar karsinogen. Pada titik ini kami melanjutkan untuk melakukan tes mahal dengan waktu eksekusi yang sangat lama.

TAHAP: dalam fase ini sejumlah variabel hewan, dari 20 hingga 50, dikenakan tes jangka panjang.Tes ini sangat mahal dan membutuhkan waktu lama untuk mendapatkan hasil tertentu; kita berbicara tentang 1/8 dari kehidupan hewan.Ada kemungkinan bahwa selama proses tes ini beberapa hewan mati, tetapi mereka selalu dipelajari dengan pemeriksaan otopsi dan jenis histologis. Hewan yang dipilih selalu tikus dan mencit dan hanya 70-80% yang bertahan sampai akhir tes jangka panjang. Hewan yang digunakan baru disapih, karena semakin muda, semakin sensitif terhadap perawatan. Selama periode pengujian jangka panjang, peneliti selalu didukung oleh ahli matematika-statistik, yang mampu memperhitungkan semua informasi yang dikumpulkan dan mereproduksi berbagai data.

Dosis yang diuji pada hewan dimulai dari dosis toleransi maksimum dan semua submultiplenya, dan reaksi dosis-respon pada hewan dievaluasi.
Pemberian harus selalu mendekati rute yang melaluinya manusia dapat bersentuhan dengan zat yang diperiksa, oleh karena itu rute oral, kulit atau pernapasan, sedangkan jika karsinogenisitas suatu obat diuji, juga berguna untuk melakukan pemberian intravena.
Kelompok hewan yang diuji adalah 4 (50 hewan untuk setiap kelompok):

Sebuah kelompok NAIF yang tidak memiliki pengobatan;
Rombongan dirawat dengan kendaraan;
Kelompok yang diberi bahan uji;
Kelompok yang diobati dengan karsinogen yang diketahui.

Sangat penting bahwa jumlah hewan dalam setiap kelompok adalah sama mungkin.Bahkan, jika ada terlalu banyak perbedaan dalam jumlah hewan, uji statistik dapat menjadi palsu.
Evaluasi yang dilakukan adalah :

Frekuensi total tumor;
Frekuensi beberapa tumor;
Frekuensi hewan dengan lebih dari satu jenis tumor;
Jumlah kanker hewan.

Pada akhir semua fase penelitian ini, zat tersebut diklasifikasikan dalam peringkat yang ditetapkan oleh IARC (Badan Internasional untuk Penelitian dan Pengembangan Kanker) dan oleh Badan Perlindungan Lingkungan (EPA).